Biodegradace a toxicita chlorovaných uhlovodíků: Role molekulární genetiky

Chlorované uhlovodíky (ClU) patří mezi nejrozšířenější kontaminanty životního prostředí. V 2. polovině minulého století byl vyráběn především perchloretylen (PCE), který byl hojně používán k chemickému čištění oděvů či jako rozpouštědlo a průmyslové odmašťovadlo. Pro odstraňování ClU je možné využít jak biologických, tak chemických metod či jejich vzájemných kombinací, které se v současnosti jeví jako nejefektivnější. Kombinace biologických a chemických metod se začaly hojněji využívat až v 90. letech minulého století. Rozvoj metod molekulární genetiky, a to zejména pokročilých sekvenačních metod, navíc umožnil rozsáhlé studium mechanismů biologické degradace ClU.

Posun od mechanických způsobů jako je odtěžení či chemických (oxidativní i reduktivní) forem čištění směrem ke kombinovaným, tj. chemicko-biologickým nebo čistě biologickým postupům vytvořil prostor pro uplatnění molekulární genetiky i v této oblasti. V předkládaném článku jsou shrnuty jednotlivé metody a vysvětleny možnosti jejich použití, výhody i limitace. Dále jsou uvedeny případové studie, ve kterých jsou hodnoceny konkrétní lokality a situace z pohledu molekulární genetiky.

Kontaminace chlorovanými uhlovodíky

Kromě původní kontaminace způsobené perchloretylenem (PCE) a trichloretylenem (TCE) je na kontaminovaných lokalitách v podzemních vodách přítomna také tzv. „sekundární“ kontaminace. Ta je způsobena přirozeně vznikajícími meziprodukty rozkladu PCE a TCE, tj. dichloretylenem (cis-DCE) a vinylchloridem (VC), které jsou navíc toxičtější než původní kontaminanty [1, 2]. Do biodegradace je zapojeno široké spektrum bakterií s různými dehalogenačními schopnostmi. Přítomnost a aktivita těchto bakteriálních konsorcií je determinována vlastnostmi daného prostředí. Schopnost bakterií degradovat ClU není omezena pouze na anaerobní prostředí, ale může probíhat také v aerobních podmínkách [3]. V anaerobním prostředí je však biodegradace (anaerobní respirace) mnohem častější, přičemž ClU jsou využity jako akceptory elektronů. Při aerobních podmínkách jsou ClU naopak využity jako donory elektronů. Za aerobních i anaerobních podmínek může také docházet ke kometabolickému rozkladu kontaminantů, přičemž pro správný průběh rozkladu je nutná přítomnost dalšího organického substrátu, např. Přirozená i podporovaná biodegradace ClU v podzemních vodách, využívající přirozeně se vyskytující (autochtonní) bakteriální konsorcia, je levnější a zároveň šetrnější k životnímu prostředí, než sanace založená na reakci exogenního chemického činidla s daným kontaminantem.

Procesy biodegradace ClU

Existují různé cesty, kterými mohou být ClU degradovány:

• Reduktivní dehalogenace: Hlavním degradačním pochodem v anaerobním prostředí [6]. Kromě anaerobních podmínek je nutná přítomnost donoru elektronů - vodíku, který vzniká fermentací organických látek. Jako akceptor elektronů slouží přítomné ClU, přičemž energie uvolněná při dehalogenační reakci je využita pro růst bakterií. Rychlost reduktivní dehalogenace je ovlivněna jak biogeochemickými procesy, tak i množstvím dostupného vodíku [7]. Akumulace toxických meziproduktů, konkrétně cis-DCE a VC, může být způsobena jak částečnou dechlorací, tak sníženou rychlostí dechlorace, eventuálně jejich vzájemnou kombinací [3]. Jediným doposud známým mikroorganismem, který je schopný degradovat PCE až na etan/eten pomocí anaerobní reduktivní dehalogenace, je bakteriální rod Dehalococcoides [8]. Dále bylo popsáno množství druhů, které degradují vždy pouze určitý ClU, například Desulfitobacterium spp., Dehalobacter spp.
• Aerobní biodegradace: Další možnou cestou dekontaminace ClU je jejich aerobní biodegradace. Během ní jsou ClU využity jako donor elektronů, přičemž dostatečné jsou i velmi nízké koncentrace kyslíku [10]. Aerobní biodegradace ClU je popsána pro TCE , cis-DCE [1] a VC [11]. Bakteriálních druhů schopných aerobní degradace VC je v porovnání s anaerobní biodegradací mnohem více. Jedná se např. o Mycobacterium sp. [12], Nocardioides sp. [13], Ochrobactrum sp. [14], Pseudomonas aeruginosa [15] či Ralstonia sp [16]. Při aerobní biodegradaci se uplatňují především enzymy mono- a dioxygenázy.
• Kometabolická biodegradace: Kometabolická cesta biodegradace ClU probíhá jak za aerobních, tak za anaerobních podmínek. Při tomto procesu biodegradace jsou ClU degradovány „náhodně“. Tzn., že do metabolických drah příslušných bakterií, např. metanogenních nebo síru a železo redukujících, vstupují ClU společně s jinými substráty, aniž by je bakterie degradovaly s jakýmkoliv ziskem energie či uhlíku [17]. Tyto bakterie využívají jako primární substrát jiné látky než ClU (např. toluen, katechol, metan, etanol a jiné). Z tohoto důvodu jsou ClU při kometabolickém rozkladu degradovány enzymy s jinou substrátovou specifitou. Pokud poklesne koncentrace primárního substrátu pod určitou hladinu, dojde k zastavení celého kometabolického procesu [18]. Enzymy zapojené do kometabolické biodegradace jsou převážně mono- a dioxygenázy, konkrétně například katechol 1,2-dioxygenáza, toluen dioxygenáza a metan monooxygenáza [19]. Kometabolické biodegradace ClU se může účastnit mnoho bakteriálních druhů, např. Pseudomonas sp. [20], Comamonas testosteroni [21], Mycobacterium vaccae [22], Rhodococcus sp.

Molekulárně-genetické metody pro studium biodegradace ClU

V současné době jsou velmi intenzivně sledovány změny ve složení autochtonní mikroflóry podílející se na biodegradaci nejrůznějších kontaminantů z podzemních vod. V případě ClU se jedná především o proces reduktivní dehalogenace za anaerobních podmínek [24]. S rozvojem molekulárně-genetických metod dochází k hlubšímu poznání nejen mikrobiálních společenstev, ale i enzymů zapojených do jednotlivých biodegradačních drah.

Čtěte také: Proces biodegradace: Vysvětlení

Základní metody

Mezi základní molekulárně-genetické metody patří:

• Polymerázová řetězová reakce (PCR): Základní molekulárně-genetickou metodou, která umožňuje získat přehled o procesech probíhajících na kontaminované lokalitě, je polymerázová řetězová reakce (PCR). Jedná se o metodu, na jejímž principu a modifikaci je postavena většina dalších molekulárně-genetických analýz. V prvním kroku dojde k denaturaci molekul DNA pomocí vysoké teploty. Druhý krok slouží k navázání specifických primerů, což jsou krátké sekvence DNA, které se specificky váží na konkrétní místa genomu. Teplota, při které probíhá druhý krok, se odvíjí od jejich sekvence. V třetím kroku dochází k syntéze vlastního vlákna, a tedy ke vzniku nové kopie testované DNA. Výše popsané kroky se cyklicky opakují tak, aby došlo k dostatečnému namnožení testované sekvence a bylo možné signál vizualizovat. Doba jednotlivých kroků je závislá na použitých chemických činidlech, proto údaje uvedené na obrázku jsou pouze orientační. Konečným krokem zviditelnění signálu je v tomto případě gelová elektroforéza, jejíž výsledek je uveden na obr. 1c.
• Real-time PCR: Jedná se o pokročilou formu PCR založené na detekci fluorescenčního signálu. Ten je vyzářen buď pomocí sond, nebo fluorescenční barvy (např. SYBR Green). Měření fluorescenčního signálu po skončení každého cyklu PCR reakce. Intenzita fluorescence následně slouží k výpočtu relativní nebo absolutní kvantity. Relativní kvantifikace umožňuje zjišťování trendů, tedy růst nebo pokles signálu vůči původnímu stavu. V případě biodegradace ClU (aerobní i anaerobní cestou) lze pomocí real-time PCR sledovat jak pokles či nárůst signálu pro geny enzymů predikujících aktivně probíhající biodegradační proces (např. pceA, vcrA, bvcA, monooxygenázy, hydrolázy), tak i jednotlivé bakteriální rody podílející se aktivně na biodegradaci ClU (např.
• Sangerovo sekvenování: Sangerovo sekvenování je verifikačním nástrojem sloužícím ke kontrole např. specifičnosti zvolených primerů nebo k přesnému taxonomickému zařazení čistých bakteriálních kultur získaných kultivačními metodami. Metodika je založená opět na principu PCR reakce a využívá možnosti fluorescenčního značení dideoxynukleotidů (ddNTP), za kterými již není možné pokračovat v syntéze nově vznikajícího řetězce DNA.
• NGS analýza: NGS analýza je relativně nový přístup molekulární genetiky, který nachází uplatnění v širokém spektru analýz. V případě environmentálních vzorků lze NGS metodou detailně analyzovat směsné vzorky bakteriálních komunit. Tato metoda, jako jediná, analyzuje složení komplexní bakteriální komunity bez nutnosti klonování sledovaných úseků DNA do vektorů a následné kultivace v buňce. Analyzovány a porovnávány mohou být například bakteriální komunity z různých hloubek, z různých kontaminovaných lokalit či jiných vzorků. Jediným omezením NGS metody je vstupní koncentrace izolované DNA, která musí být vyšší než 2 ng·µl-1. Metoda NGS též umožňuje sekvenovat celé bakteriální genomy, a to jak v případě směsných vzorků (metagenom), tak i komplexní genomy izolátů bakteriálních kmenů. V neposlední řadě je možné sledovat profily aktivně přepisovaných genů pro enzymy, které provádí konkrétní činnosti, nebo aktivně se množících bakteriálních kmenů pomocí sekvenace mRNA. Analýza umožňuje sledovat např. Jednou z možných metod NGS sekvenování, která byla použita i v této případové studii, je detekce změny hodnot pH pomocí přístroje Ion Torrent (Life Technologies, USA). Při detekci signálu se využívá principu amplifikace, kdy je při každém napojení báze uvolněn proton vodíku. Uvolněné protony vodíku změní hodnotu pH, která je následně detekována. Jedná se o systém, který při detekci nepotřebuje žádné světelné signály a může tak použít nejkvalitnější a nemodifikované enzymy.

Případové studie

Dvě různé lokality kontaminované ClU byly hodnoceny pomocí vybraných markerů a metody PCR. V tabulce 1 je uveden výsledek monitoringu bakterií schopných dehalogenace (Dehalococcoides spp., Dehalobacter spp., Sulfurospirillium spp.) a specifických genů pro expresi enzymů, které se účastní degradace VC (vcrA, bvcA).

Tabulka 1. Ilustrační výsledky PCR reakce ze dvou lokalit kontaminovaných ClU. Sanační zásah (aplikace syrovátky) byl proveden po prvním a druhém odběru.

Výhodou PCR reakce je její finanční nenáročnost, která tuto metodu řadí mezi nejlevnější molekulárně-genetické analýzy.

Real-time PCR a vývoj markerů

Real-time PCR reakce umožňuje přesnou kvantifikaci vývoje jednotlivých sledovaných markerů. Po aplikaci substrátu do vrtu došlo k nárůstu relativní četnosti u všech sledovaných markerů. Jak je patrné z tohoto obrázku, již jeden den po aplikaci byl pozorován vzestup hladin obou sledovaných specifických enzymů pro degradaci VC, tj. vcrA i bvcA. Třetí den od aplikace došlo také k nárůstu relativní četnosti markeru pro Dehalococcoides spp. Bylo tedy identifikováno zvýšení všech markerů spojených s biodegradací ClU. Od třetího dne, kdy jednotlivé markery dosáhly nejvyšších hodnot relativní kvantity, byl dále pozorován jejich pokles, a to na hodnoty přibližně stejné jako před aplikací.

Čtěte také: O biodegradaci a sanaci

NGS analýza a diverzita bakterií

Cílem NGS analýzy bylo v tomto případě porovnat diverzitu bakterií v podzemní vodě kontaminované ClU s diverzitou bakterií narostlých na nanovlákenných nosičích umístěných ve stejné vodě. Dále byly analyzovány změny ve složení bakteriální komunity na této lokalitě mezi dvěma odběry, kdy byla do vrtu aplikována syrovátka jako substrát pro podporu biodegradačních procesů. Z výsledků analýz je patrné, že bakteriální diverzita se na úrovni kmene, v případě prvního odběru, podobala diverzitě bakterií detekované na nanovlákenném nosiči. Rozdíly mezi 1. a 2. odběrem, tedy před a po aplikaci syrovátky, byly však již znatelné. Majoritní výskyt ve vzorku podzemní vody vykázala čeleď Methylophilaceae, zatímco na nanovlákenném nosiči byla tato čeleď zastoupena je velmi raritně. Ostatní skupiny se víceméně shodovaly a jednotlivé rozdíly byly způsobené především vlastnostmi sekvenování, než skutečnými rozdíly v diverzitě. Byl však pozorován významný posun ve složení bakteriální komunity mezi 1. a 2. odběrem. Došlo k potlačení kmene Proteobacteria a naopak k proliferaci kmene Firmicutes. Tato skupina je přímo spojována s degradací ClU a zároveň je přítomna v syrovátce. Byly pozorovány tři majoritní čeledi již dříve publikované v souvislosti s výskytem na lokalitách kontaminovaných chlorovanými etyleny (Ruminococcaceae, Moraxellaceae a Lachnospiracea). Změna může být vysvětlena aplikací malého množství syrovátky (0,2 m3) do tohoto vrtu, navíc s nízkou rychlostí proudění podzemní vody. Bakterie kmene Firmicutes jsou v syrovátce významně zastoupeny, tudíž ovlivnily i 2. Souhrnně lze konstatovat, že NGS analýzy poskytují komplexní obraz o dané lokalitě z hlediska mikrobiálního osídlení.

Čtěte také: Více o anaerobní biodegradaci a jejích produktech

tags: #rihova #ambrozova #biodegradace #a #toxicita

Oblíbené příspěvky:

• Zázraky přírody: Duhové hory
• The Work of Naďa Vinecká in Film and Theatre
• Nevykazující emise do ISPOP
• Právní předpisy ČR
• Sada pro kondenzát AEG