Charakteristická vlnová délka emise a její definice

Absorpce světla se využívá v biochemických stanoveních nejdůležitějších látek obsažených v biologických tekutinách. Jen málo látek můžeme stanovit takzvanou přímou spektrofotometrií. Jako příklad takové látky je stanovení bilirubinu u novorozenců. Je tomu tak proto, že bilirubin absorbuje při určité vlnové délce a sérum novorozenců ještě neobsahuje žádné látky, které by absorbovaly při této vlnové délce a tím stanovení rušily. Jakmile je novorozenec přiživován, může sérum obsahovat absorbující látky a přímá spektrofotometrie není možná. Většinu látek stanovujeme po přídavku nějakého činidla, které reaguje s látkou, kterou chceme stanovit, a vytváří produkt, který specificky absorbuje v určité oblasti viditelného nebo ultrafialového spektra.

Prakticky vždy je naší snahou použít takovou vlnovou délku světla, které je co nejvíce absorbované. Při vzniku barevného produktu můžeme z výše uvedené tabulky usuzovat na vlnovou délku, kterou lze při spektrofotometrických stanoveních využít. Při této vlnové délce je nejvyšší citlivost měření. Máme-li tedy měřit žluté produkty reakce, použijeme vlnovou délku cca 450 nm, modrý filtr. Bezbarvé roztoky mohou absorbovat neviditelné ultrafialové záření 340 nm.

Absorbce světla a transmitance

Zářivý tok φ0 je při dopadu na kyvetu s barevným roztokem ochuzen o odražené, rozptýlené a absorbované záření. Z kyvety nám tedy vystupuje zeslabený zářivý tok φ , který můžeme měřit. Relativní část prošlého záření vyjádřená v procentech se nazývá transmitance (propustnost) T.

Transmitance se mění inverzně, se stoupající koncentrací absorbujících produktů klesá, a to logaritmicky. Z tohoto důvodu byl zaveden záporný logaritmus transmitance, který se nazývá absorbance. Závislost absorbance na koncentraci je lineární. Měřením proti slepé zkoušce se přímka posune k nule.

A = - log T

Čtěte také: Charakteristická Emise a Chemické Složení

Absorbance je bezrozměrné číslo, které může nabývat hodnot od nuly (T=100%), maximální propustnost, až k nekonečnu, při prakticky nulové propustnosti. Pro nás je důležité, že absorbance je přímo úměrná koncentraci a tloušťce absorbující vrstvy.

Lambert-Beerův zákon

Tento vztah je vyjádřen Lambert-Beerovým (L.B.) zákonem, kde konstanta úměrnosti je molární absorpční koeficient (ε ):

A = ε . c . d

• ε = molární absorpční koeficient, je konstanta charakteristická pro měřenou látku. Při platnosti L.B. zákona je nezávislá na koncentraci absorbující látky.
• c = látková koncentrace (mol/l)
• d = tloušťka absorbujícího prostředí (kyvety) (cm)
• A = absorbance (bezrozměrné číslo)

Zákon L.B. je zákonem mezním, tj. platí:

• pro monochromatické světlo
• pro zředěné roztoky (koncentrace absorbující látky musí být menší než 0,01 mol)
• za předpokladu, že absorbující částice nepodléhají žádným změnám (interakcím)
• za předpokladu, že v měřeném roztoku je pouze jedna absorbující složka (aditivita absorbancí)

Odchylky od Lambert-Beerova zákona nastávají:

Čtěte také: Jak správně ohlásit emise kotle?

• V roztocích, kde změnou koncentrace analyzované složky se mění chemická rovnováha
• Ve značně koncentrovaných roztocích, kde dochází ke změně indexu lomu a tomu odpovídá odchylka od lineárního průběhu
• V roztocích s koloidními částicemi (odraz a rozptyl), nespecifická absorpce s difuzním rozptylem, falešná absorpce záření, zvýšení intenzity sekundárním rozptylem ve směru paprsku
• Při fluorescenci částic přítomných ve vzorku, sekundárně emitované záření budí dojem, že propustnost je vyšší, absorbance se s rostoucím počtem částic snižuje, lze potlačit vhodným filtrem nebo bichromatickým měřením
• Ve složité matrici vzorku, pozadí (lipémie, bilirubin, hemoglobin)
• Při nedostatečná monochromatičnosti světla (filtr 10-50 nm, hranol 1 -10 nm, mřížka 0,5-2 nm)
• Při špatně zvolenýchexperimentálních podmínkách (nedostatečná, nízká konc.činidla, krátká reakční doba atd.)

Chyby měření absorbance

Nejpřesnější měření absorbance je v rozmezí transmitance 15 - 65 %, což odpovídá absorbanci mezi 0,2 - 0,8. S většími a menšími hodnotami chyby narůstají. Nutno podotknout, že kvalitní moderní přístroje dokáží měřit absorbanci do vyšších hodnot a udané rozmezí platí hlavně pro manuální práci, ale snažíme se upravit poměry vzorku a činidel tak, aby chyby byly ve stanoveném rozmezí, které je pro každou metodu jiné.

Absorpční spektrum

Absorpční spektrum se nejčastěji graficky vyjadřuje jako závislost A na vlnové délce. Získá se měřením A při různých vlnových délkách manuálně, nebo pomocí registrujících automatických spektrofotometrů. Při zavádění metody je dobré znát spektrum pro vzorek, kalibrační materiál a slepou zkoušku (neobsahuje měřený analyt). Nejlepší kalibrátory jsou ty, které mají podobné složení jako měřené vzorky, zde se dá předpokládat i podobné absorpční spektrum. Vlastní měření se nejčastěji provádí v maximu, kde je nejvyšší hodnota molárního absorpčního koeficientu, a tím největší citlivost a nejmenší chyby při nedostatečné monochromatičnosti světla.

Vzájemné přeměny oxidované a redukované složky se využívá jako identifikační reakce v celé řadě biochemických stanovení.

Přístrojové vybavení

Přístroje na měření absorbance se nazývají fotometry. Jako spektrofotometr se obvykle označuje fotometr s lepší spektrální kvalitou záření (mřížka, hranol), často lze na něm zaznamenat automaticky absorpční křivku. Můžeme je dělit na:

• jednopaprskové přístroje, které měří postupně nejdříve neabsorbované záření (slepou zkoušku) a potom absorbanci vlastního vzorku
• dvoupaprskové přístroje, které porovnávají po průchodu monochromátorem, dva paprsky, jeden jde přes neabsorbující prostředí slepé zkoušky a druhý současně přes absorbující vzorek.

Základní části spektrofotometrů:

Čtěte také: Porovnání aktivity a emise

• zdroj zářivé energie
  • žárovka s wolframovým vláknem plněná inertním plynem (krypton, argon, dusík) dává pouze 15% zářivé energie, využívá se hlavně pro viditelnou oblast (VIS)
  • halogenová žárovka obsahuje stopy halogenu k wolframovému vláknu, záření je posunuto do blízké UV oblasti (od 320 nm),.Tento zdroj často využívají spektrofotometry a analyzátory používané v klinických laboratořích
  • výbojky dávají spojité i nespojité záření pro UV-VIS spektrum, jsou to trubičky naplněné plynem nebo parami, proud prochází jako obloukový (doutnavý) výboj a elektron způsobuje excitaci atomů. Nejčastěji využívané: deuteriová výbojka, rtuťová výbojka (spektrální Hg lampa), u které využíváme určité vlnové délky dané čarovým spektrem rtuťové výbojky.
  • Laser (Light Amplifier by Stimulated Emission of Radiation) v překladu zesílení světla pomocí stimulované emise záření. Výhody tohoto druhu záření:
    • vysoká monochromatičnost světla a frekvenční stabilita
    • malá rozbíhavost koherentní záření, vlny jsou zfázované, extrémní soustředění záření do úzkého paralelního svazku, laserové paprsky je možné vysílat na značnou vzdálenost
    • příkladem může být helium-neonový plynový laser, vlnová délka 632,8 nm
• disperzní zařízení, monochromátory
  • Slouží k izolaci úzkého pásma vlnových délek z polychromatického zdroje záření. Čím je užší pásmo vlnové délky, tím je metoda selektivnější, správnější, citlivější a lépe reprodukovatelná při přechodu na jiný analyzátor, který musí mít podobně kvalitní disperzní zařízení. Vlnová délka měření se nejčastěji vybírá v maximu absorpčního spektra měřené látky, kde je metoda nejcitlivější a nejlépe reprodukovatelná. Existují výjimky, kdy se měří mimo maximum, když potřebujeme potlačit současné absorbance interferujících látek nebo posunout absorbanci cíleně k nižším hodnotám. Kvalitu disperzního zařízení hodnotíme podle pološířky, což je rozpětí vlnových délek v polovině maximální propustnosti zařízení. Čím je interval užší, tím je kvalitnější výběr vlnové délky
  • filtry (10 - 50 nm)
  • hranol 1 - 10 nm)
  • reflexní mřížka (0,5 - 2 nm)
• absorpční prostředí
• detektory záření převádějí optický signál na měřitelný elektrický. Používají se jednoduché fotoelektrické články a polovodičové články, které pokrývají celý měřící interval vlnových délek. Na takových zařízeních nazývaných diode array detektory je možno měřit současně při různých vlnových délkách

Postupy pro stanovení koncentrace látek (kalibrace)

Pro stanovení koncentrace základních látek v biologických tekutinách musíme příslušnou metodu kalibrovat. Kalibraci provádíme pomocí standardních roztoků. Nejjednodušší je využití dvou standardních roztoků, kdy jeden standardní vzorek neobsahuje měřenou látku, říkáme mu také slepá zkouška (blank), a druhý standardní vzorek má vhodnou koncentraci sledované látky. Tímto způsobem kalibrace předpokládáme, že pro stanovení platí Lambert - Beerův zákon.

Kalibrační materiál by se měl spektrofotometricky chovat podobně jako vzorek biologického materiálu. Z tohoto důvodu se někdy místo vodných roztoků používají kalibrátory mající obdobné složení jako vzorek se známým obsahem stanovovaných látek. Pomocí takto připravených kalibrátorů můžeme kalibrovat široké spektrum metod, což je výhodné u automatických analyzátorů. Metoda je postavena tak, aby lineární kalibrace vyhovovala pro co největší počet měřených vzorků. V praxi se setkáváme se vzorky, které mají extrémně nízké nebo vysoké hodnoty. Dolní mez stanovitelnosti je dána mezí detekce, která vypovídá o citlivosti metody. Pod mezí stanovitelnosti nevydáváme číselný výsledek,pouze “menší než (< číslo meze stanovitelnosti)”. Horní mez stanovitelnosti nám udává hodnotu, kam až je metoda lineární.

Opakováním měření předepsaným ředěním se můžeme dostat do mezí, kdy je vzorek správně změřen a číselný výsledek dostaneme po vynásobení faktorem ředění. Automatické analyzátory dokáží provést ředění vzorku snížením dávkovaného objemu vzorku a naopak u nízkých hodnot zvětšením objemu vzorku. Výsledky se přepočítávají podle manipulace se vzorkem. Pro nás je důležité si uvědomit, že nejsprávnějších výsledků je dosahováno ve stanovených limitech a každá úprava vzorku přináší větší analytickou chybu a samozřejmě i zdržení způsobené opakováním analýzy. Zacvičený laborant by měl umět vysvětlit důvod, proč je vzorek opakován a extrémní hodnoty hlásit s tím, že výsledek bude upřesněn po opakování například ředěného vzorku. Včasné nahlášení možného extrému je často pro lékaře cennější než čekání na výsledek po opakování.

Kalibrace metody často platí pouze pro vzorek, který není hemolytický, ikterický nebo chylózní. V případě těchto vzorků může docházet například k absorbanci pozadí a dalším ovlivněním, výsledek pak bude zkreslen. Proto má každá metoda stanovena kritéria, kdy lze výsledek vydat, případně je k výsledku připojena varující poznámka. Ordinující lékař nebo sestra by měli být přístupni požadavku laboratoře k zaslání nového vzorku, zvlášť když je povaha vzorku ovlivněna preanalytickou chybou. Všechny rutinní metody jsou v laboratoři kontrolovány na nejméně dvou hladinách v rozmezí normálních, snížených nebo zvýšených hodnot. Když jsou hodnoty kontrol mimo stanovenou mez, provádí se upravení nebo rekalibrace metody opět s následnou kontrolou.

Některé analyticky složitější metody nejsou lineární a nebo jsou lineární pouze v určitém rozsahu. Takové metody se kalibrují na více standard (až 6) v celém rozmezí. Kalibrační křivka je vyjádřena nějakou složitější matematickou funkcí, kterou jsou schopné moderní analyzátory vypočítat a v celém rozsahu vydávat výsledky.

Průběh reakce

Reakce stanovované látky s činidly probíhá různou rychlostí. Metody jsou velmi často prováděné jako dvoučinidlové. První činidlo označované jako R1 připravuje většinou podmínky pro následnou reakci. Jeho objem bývá větší než činidla R2 a směs vzorek + R1 se určitý konstantní čas inkubuje. U rutinních analyzátorů (např. Olympus AU) je tato inkubace dlouhá 5 minut. Po této době se přidáním R2 startuje reakce stanovované látky s činidlem (substrátem). V první lag fázi se reakce rozbíhá, potom nastává nárůst absorbance, který se u metod do konečného bodu obvykle zpomaluje. U analyzátorů je tato doba opět 5 minut. Celé stanovení probíhá při konstantní teplotě 37o C. Automatické analyzátory sledují absorbanci celého průběhu stanovení. Řada analyzátorů Olympus AU má celkem 27 fotometrických měření během uvedené doby 10 minut.

Podle průběhu reakce a stanovované látky si můžeme vybrat z celé řady kombinací odečtu absorbancí:

• jednobodový test do konečného bodu (end point) - měříme jeden bod po prakticky skončené reakci
• dvojbodový test - výpočet provádíme z rozdílu absorbancí před přidáním druhého činidla a po proběhlé reakci. Při tomto způsobu je eliminována možná absorbance vlastního vzorku způsobena jeho hemolýzou, chylozitou nebo ikteritou. Další možností je dvoubodové měření po přidání druhého činidla.

tags: #charakteristická #vlnová #délka #emise #definice

Oblíbené příspěvky:

• Udržitelné záchody
• Pěstební Zóny v ČR
• Výzvy recyklace plastů
• Příprava na zkoušku z toxikologie a ekologie
• Expozice Valašského muzea