Charakterizace enzymové aktivity metodami

22.03.2026

V každém okamžiku působí v lidském těle tisíce enzymů. Enzymy jsou makromolekuly s katalytickými funkcemi, představují pestrou škálu biokatalyzátorů. Zajišťují prakticky průběh všech chemických reakcí v buňkách, obnovují opotřebované buňky a přeměňují výživné látky na energii či stavební součásti. Chrání organizmus před choroboplodným zárodkům nebo hojí poranění, jsou nezbytné pro správné fungování organizmu.

Enzymologie je věda zabývající se studiem enzymů. Představuje názvosloví enzymů, jejich kovalentní struktury a struktury kofaktorů, enzymovou kinetiku, stanovení katalytické aktivity, regulace aktivit enzymů v buňce, medicinální enzymologii, enzymové inženýrství a mechanismy enzymových reakcí. Enzymy urychlují chemické děje a udržují rovnováhu, neboť zvyšují rychlost reakce oběma směry. Nejsou pouze druh katalyzátoru, nýbrž energetické a koncentrační poměry v daném systému reakcí.

Enzymy můžeme rozdělit do několika tříd: oxidoreduktázy, transferázy, hydrolázy, lyázy, izomerázy a ligázy. Počet známých enzymů jde do miliard. Enzymy, které jsou bílkovinami, můžeme dále rozdělit na jednoduché a složené. Pokud je daný enzym tvořen pouze bílkovinou, je jednosložkový, označujeme jej jako jednoduchý. Pokud je enzym složený, obsahuje kromě proteinové složky, čili dlouhé sekvence aminokyselin v prostorově uspořádané struktuře, ještě nebílkovinnou složku - kofaktor (obvykle koenzym). Enzymy nazýváme ribozomy.

Aktivita enzymu závisí na aktivním centru (aktivní místo). Ztrácí hydratační obal a stává se tak reaktivnějším a zajišťuje vhodnou orientaci pro vazbu. Měří se stanovení enzymové aktivity enzymu v určitém preparátu, potřebného pro danou technologickou aplikaci.

Význam enzymů

Enzymy hrají podstatnou roli v průmyslu, biologicky aktivních pracích prostředcích, farmacii, kožedělném, textilním či papírenském průmyslu. To, zda je enzymový preparát k dané aplikaci vhodný, je posuzováno z různých aspektů, včetně ekonomických. Do budoucna můžeme očekávat také zvýšený zájem v oblasti výzkumu kofaktorů.

Čtěte také: Studium aktivit v přírodě

Enkapsulace enzymů

Enkapsulace je proces zachycení účinné látky do nosného materiálu, vytvářející bariéru mezi vnitřní fází a okolím. Je nástrojem pro zlepšení dodávání bioaktivních molekul a živých buněk do potravin. Může chránit enzymy během výroby i zpracování, zabránit rozkladu těkavých účinných látek, jako je například aroma, a zabránit reakcím s dalšími komponenty potravinářských produktů. Pro enkapsulaci se používají různé enkapsulační techniky.

Mezi často používané metody patří sušení rozprašováním, což je průmyslovým procesem zahrnujícím tvorbu částic a sušení. Při této metodě dochází k disperzi látky v nosiči, následné atomizaci a sprejování dané směsi do horké komory, kde dochází k tvorbě filmu na povrchu kapek. Další metodou je koacervace, kde se přidává třetí složka, označována jako koacervační médium, a dochází k oddělení koacervované fáze. Síťovacího činidla vytváří stěnu koacervátu.

Pro enkapsulaci se používají různé nosiče, do nichž je možné zapouzdřit aktivní molekuly. Cyklodextriny jsou oligosacharidy odvozené od škrobu, jejichž vnější část molekuly je hydrofilní, zatímco vnitřní část hydrofobní. Díky tomu mohou zachycovat aktivní látky prostřednictvím hydrofobní interakce. Dále se používá sacharóza. Aglomeráty, které vznikají, se následně suší na určenou vlhkost.

Nanotechnologie nabízí další možnosti, jako jsou nanočástice o velikosti do 1000 nm, například nanokapsle, přičemž aktivní látky jsou obvykle rozpuštěny v kapalném jádře. Lyofilizace se používá za účelem dehydratace téměř všech tepelně sensitivních materiálů a aromatických látek. Lipozomy umožňují účinným látkám volný prostup buněčnou stěnou a membránou a používají se pro enkapsulaci malých lipofilních molekul, jakými jsou třeba esenciální oleje. Po enkapsulaci se částice suší za vzniku prášků.

Další materiály používané pro enkapsulaci

Algináty: soli alginové kyseliny získané z hnědých mořských řas, tvoří gely či filmy za pomoci přídavku vápenatých iontů.
Chitosan: vzniká deacetylací chitinu, polysacharid s kationovými polymery.
Škrob: hlavní zásobní polysacharid rostlin, používá se jako plnidlo, želírující látka, poutač vody či nosič vonných látek.
Lecitin: řazený mezi fosfolipidy, získává se ze sóji, slunečnice, podzemnice olejné a vajec, používá se při přípravě lipozomů.
Cholesterol: sterol, který stabilizuje lipozomy.

Charakterizace částic

Pro určení velikosti částic se používá dynamický rozptyl světla, který měří intenzitu světla rozptýleného ze suspenze či roztoku. Důležitou roli hraje fakt, že větší částice se pohybují pomaleji, zatímco malé rychleji. Stabilita částic se stanovuje pomocí zeta potenciálu. Koloidní systém vzniká tehdy, je-li jedno ze tří skupenství dispergované ve skupenství jiném. Částice s hodnotou potenciálu zeta vyšší než +30 mV nebo nižší než -30 mV, se považují za stabilní. Hodnotu potenciálu zeta ovlivňuje pH.

Čtěte také: Maximální objemová aktivita radonu

V bakalářské práci se zaměřuje na enkapsulaci různých typů enzymů do organických částic za účelem stabilizace a uchování aktivity enzymů. Součástí je charakterizace částic pomocí dynamického rozptylu světla.

Experimentální postupy

Pro enkapsulaci byly použity 3 typy enzymů a 1 typ doplňku stravy enzymy obsahující. Byly použity různé postupy enkapsulace, například:

Enkapsulace do alginátu: do roztoku alginátu byl rozpuštěn vzorek určený pro enkapsulaci a následně přikapáván do roztoku chloridu vápenatého.
Enkapsulace do chitosanu: do roztoku chitosanu bylo přidáno 0,5 ml koncentrované kyseliny octové, směs byla ultrazvukována a po malých dávkách byly přidávány 4 ml 2% tripolyfosfátu sodného.
Enkapsulace do škrobu: byl poté přidán vzorek určený k enkapsulaci a po malých dávkách do 20 ml ethanolu.
Enkapsulace do lipozomů: rozpuštěn vzorek určený pro enkapsulaci a ultrazvukován po dobu 1 minuty.

Pro enkapsulaci extraktů, buněk a mikroorganizmů za sterilních i nesterilních podmínek se používají enkapsulátory, které generují částice o stejné velikosti. Tyto přístroje umožňují nastavit podmínky pro tvorbu částic o velikosti od 0,15 do 2 mm. Enkapsulátor se instaluje do uzavřené digestoře nebo rukavicového boxu, aby se zabránilo dalším situacím nebezpečným pro uživatele i okolní prostředí. Tekutina se dávkuje do stříkačky nebo tlakové láhve a pomocí vzduchu se vytvářejí jednotlivé kapičky o stejné velikosti. Elektroda způsobí, že získají povrchový náboj, což vede k rozptýlení částic dopadajících do vytvrzovacího roztoku.

Stanovení koncentrace proteinů a enzymové aktivity

Pro stanovení koncentrace proteinů byla použita Hartree-Lowryho metoda. Enzymová aktivita byla stanovena nejdříve v roztoku enzymu určeného k enkapsulaci a poté v supernatantu. Velikost částic byla stanovena pomocí přístroje ZetaSizer Nano ZS. Stabilita částic byla měřena pomocí Zeta Dipp cely.

Stabilita částic v modelových roztocích

Pro testování stability byly použity modelové roztoky: pankreatická šťáva, žaludeční šťáva a žlučová šťáva. Dále byl testován vliv modelových potravin, jako je ocet a tukové potraviny. Stabilita byla sledována po 1 týdnu a 1 měsíci pomocí stanovení koncentrace proteinů.

Čtěte také: Udržitelné cestování v Česku

Výsledky a diskuze

Procento enkapsulovaného enzymu v supernatantu po enkapsulaci bylo určeno pomocí stanovení koncentrace proteinů. Nejvyšší procenta enkapsulace u alginátových částic byla pozorována až na pankreatin. Z tabulky vyplývá, že nejlépe se do částicích enkapsuloval enzym trypsin. Co se týče stanovení enzymových aktivit, nejhůře se enkapsuloval jen enzym trypsin, a to v případě škrobových a lipozomových částic. Pomocí stanovení koncentrace proteinů se nejlépe enkapsuloval pankreatin, hůře pak bromelain s trypsinem.

Velikost částic byla stanovena pomocí přístroje ZetaSizer Nano ZS. Největší průměr vykazovaly částice škrobové, nejmenší pak u částic lipozomových. Co se týče stability, za stabilní částice můžeme označit chitosanové a lipozomové. Škrobové do rozmezí stability nespadají, jsou tedy nestabilní.

Stabilita částic byla testována v pankreatické, žaludeční a žlučové šťávě. Stabilita částic v pankreatické šťávě byla určena pomocí stanovení koncentrace proteinů. Dle hodnot uvedených v tabulce byla stabilita u jednotlivých částic velmi odlišná. Jako nejméně stabilní se v pankreatické šťávy můžeme považovat částice škrobové. Dle hodnot uvedených v tabulce byla stabilita uvolnění proteinů z jednotlivých typů částic. V kyselém prostředí žaludeční šťávy jsou stabilními částicemi alginátové. Stabilita částic ve žlučové šťávě byla určena pomocí stanovení koncentrace proteinů. Stabilita uvolnění proteinů z jednotlivých typů částic zde byla výrazná. Celkově lze říci, že nejvyšší stabilita enzymů stanoveno u částic alginátových. Jako nejméně stabilní potom částice lipozomové.

Tabulky s výsledky

Vzhledem k rozsahu a formátu dat v původním textu, kompletní tabulky s výsledky nebyly v tomto formátu zahrnuty. Nicméně, níže je uveden příklad, jak by taková tabulka mohla vypadat, založený na poskytnutých informacích: