Žádný problém spojený s buněčnými kulturami není tak všeobecně rozšířený jako ztráta kultury v důsledku kontaminace. Všichni pracovníci a všechny laboratoře pracující s buněčnými kulturami tuto zkušenost mají.
Kontaminace kultury může být biologická nebo chemická, viditelná nebo neviditelná, destruktivní nebo vypadající neškodně. Ve všech případech však nepříznivě ovlivňuje jak použití vaší buněčné kultury, tak kvalitu výzkumu.
Nejočividnější následek kontaminace buněčné kultury je ztráta vašeho času, peněz (za buňky, kultivační nádoby, média a séra) a energie vynaložené na udržování kultur a přípravu experimentů. Nicméně, právě ty méně zřejmé následky jsou často vážnější.
Předně jsou zde nepříznivé následky na kultury trpící neodhalenou chemickou nebo biologickou kontaminací. Tyto skryté kontaminanty mohou dosáhnout vysokých koncentrací a ovlivnit růstové a jiné vlastnosti kultur. Produkty vyráběné pomocí těchto kultur, jako jsou vakcíny, léčiva nebo monoklonální protilátky, budou pravděpodobně nepoužitelné.
Prevence kontaminace buněčných kultur je již dlouho snem mnoha vědců, pro většinu je to však sen velmi obtížný, ne-li neuskutečnitelný. Kontaminace nemůže být úplně eliminována, může však být řízeně snížena jak frekvence výskytu, tak závažnost následků.
Čtěte také: In vitro kultivace a kontaminace
Chemická kontaminace buněčných kultur
Kontaminanty buněčných kultur mohou být definovány jako součást kultivačního systému, která je nechtěná z důvodu možných nežádoucích vlivů na systém nebo jeho použití. Chemická kontaminace jde nejlépe popsat jako přítomnost nějaké neživé substance, která má nežádoucí vliv na kultivační systém. Detailnější definice je však obtížná; i základní živiny mohou být v dostatečně vysokých koncentracích toxické. Toxicita navíc není jediným problémem.
Většina chemických kontaminant se nachází v kultivačním médiu a pochází buď z reagencií a vody použité k jejich přípravě, nebo z doplňkových látek, např. séra. Reagencie by vždy měly být té nejvyšší kvality a čistoty a musí být náležitě skladovány, aby nedošlo k jejich degradaci. Ideálně by měly být certifikovány pro použití v buněčných kulturách buď výrobcem, nebo před použitím vědecky zhodnoceny.
Séra přidávaná do médií jsou již dlouhou dobu zdrojem jak chemické, tak biologické kontaminace. Díky screeningovým programům buněčné kultivace v současnosti používaným dobrými výrobci sér je neobvyklé nalézt šarži fetálního hovězího séra, která by byla toxická pro většinu buněčných kultur. Na druhou stranu je u různých šarží séra běžné nalézt výrazné rozdíly v podpoře růstu pro konkrétní buněčné systémy, především pro kultury se speciálními nebo odlišnými vlastnostmi.
Také nezapomeňte na to, že sérové proteiny v médiu mají schopnost vázat podstatné množství chemických kontaminantů, především těžkých kovů, které mohou do kultivačního systému vstupovat z jiných zdrojů, a tím je učinit méně dostupné buňkám, čímž sníží jejich toxicitu.
Voda používaná pro přípravu médií a mytí skleněného vybavení je častým zdrojem chemické kontaminace a vyžaduje speciální pozornost pro zajištění její kvality. Tradičně byla doporučována jako nejlepší zdroj vysoce kvalitní vody pro kultivační média a roztoky dvojitá nebo trojitá destilace. Nyní většina purifikačních systémů kombinuje reverzní osmózu, iontoměniče a ultrafiltraci a je schopna odstranit zbytkové kovy, rozpuštěné organické látky a endotoxiny. Nicméně tyto systémy musí být správně udržovány a servisovány pro zajištění stálé kvality vody.
Čtěte také: Hypernatremie: Příčiny a důsledky
Jelikož se chová jako agresivní rozpouštědlo, může vysoce purifikovaná voda vyplavovat potenciálně toxické kovové ionty z laboratorního skla nebo kovových trubek a změkčovadla z plastikových skladovacích sáčků, nádob nebo zkumavek. Tato kontaminace pak může skončit v médiu nebo být uložena ve skladovacích nádobách a pipetách během promývání a omývání.
Endotoxiny, součást lipopolysacharidů tvořených gramnegativními bakteriemi, jsou dalším zdrojem chemické kontaminace buněčných kultivačních systémů. Tyto vysoce biologicky reaktivní molekuly mají hlavní vliv in vivo na humorální a buněčné systémy. Práce zaměřené na endotoxiny v in vitro systémech ukázaly, že mohou ovlivnit růst nebo chování kultur a jsou prokazatelným zdrojem variability experimentů.
Jelikož se buněčnou kultivací získávají některá léčiva, např. V minulosti bývaly hlavním zdrojem kontaminace endotoxiny v buněčné kultivaci séra. Zdokonalení detekce endotoxinů (LAL) vedlo ke zvýšení povědomí o potenciálních problémech buněčné kultivace spojené s endotoxiny a většina výrobců značně snížila jejich množství v sérech zpracováním produktů za aseptických podmínek.
Dalším zdrojem kontaminace mohou být média skladovaná ve skleněných nebo plastových lahvích, které předtím obsahovaly roztoky těžkých kovů nebo organické látky, jako jsou barviva na elektronovou mikroskopii, rozpouštědla a pesticidy. Kontaminace může být adsorbována na povrch lahví nebo uzávěrů (nebo absorbována do lahve, je-li z plastu) během skladování původního roztoku. Pokud jsou během promývacího procesu odstraněny pouze částečně, mohou se během kontaktu s kultivačním médiem postupně uvolňovat zpět do roztoku.
Důležitý, avšak často přehlížený zdroj chemické kontaminace pochází z vystavení média obsahujícího HEPES (4-2(-hydroxyethyl)-1-piperazin ethansulfonová kyselina - organický pufr běžně používaný k doplnění bikarbonátových pufrů), riboflavin nebo tryptofan fluorescenčnímu záření. Tyto složky média mohou být fotoaktivovány a produkovat peroxid vodíku nebo volné radikály, které jsou pro buňky toxické. Čím delší expozice, tím vyšší toxicita. Krátkodobé vystavení média tlumenému osvětlení nebo běžnému osvětlení v místnosti během manipulace s kulturou běžně není zásadním problémem.
Čtěte také: Životní Prostředí a jeho Znečištění
Zdrojem chemické kontaminace může být také inkubátor, který je též často pokládaný za hlavní zdroj biologické kontaminace. Směs plynů (běžně obsahující oxid uhličitý pomáhající regulovat pH média) procházející skrz několik inkubátorů může obsahovat toxické nečistoty, především oleje a jiné plyny jako oxid uhelnatý, které mohou být předtím použity ve stejném skladovacím tanku nebo tlakové lahvi. Tento problém je velmi ojedinělý u plynů v medicínské čistotě, je však velmi běžný u levnějších směsí plynů v průmyslové jakosti.
Pozornost musí být také věnována tomu, aby byla při připojování nových tlakových lahví připojena správná láhev se správným plynem. Dalšími potenciálními chemickými kontaminanty jsou toxická, těkavá rezidua zůstávající po čištění a dezinfekci inkubátorů.
Biologická kontaminace buněčných kultur
Bakterie, plísně a kvasinky jsou prakticky všudypřítomné a jsou schopny rychle kolonizovat a prosperovat v bohatém a relativně bezbranném prostředí buněčných kultur. Díky své velikosti a rychlému růstu jsou tyto mikroorganismy nejběžnější kontaminací buněčných kultur, s jakou se můžete setkat. Při absenci antibiotik by mikroorganismy měly být v kultuře snadno detekovatelné několik dní od kontaminace, buď přímým mikroskopickým pozorováním, nebo změnami způsobenými v kultuře (změna pH, zákalu a destrukce buněk).
Kontaminanty, které zůstávají nezjištěny, jsou zdaleka nejzávažnějším problémem buněčné kultivace. Ve výsledku je to až doba, po kterou kontaminace unikala odhalení, která určuje rozsah škod, které napáchala ve Vaší laboratoři, na výzkumných projektech a nebo Vaší reputaci. Nicméně i při rutinním použití antibiotik při kultivaci mohou rezistentní mikroorganismy vést k malé, pomalu rostoucí infekci, která je přímým vizuálním pozorováním jen velmi obtížně zjistitelná.
Podobný problém s detekcí mohou vykazovat přirozeně pomalu rostoucí organismy nebo velmi malé či intracelulární bakterie, které je během rutinního mikroskopického pozorování kultury velmi těžké vidět. Tato skrytá kontaminace se může vyskytovat v kultuře dlouhodobě a může způsobovat drobné, avšak signifikantní odchylky v jejím chování.
Díky svým extrémně malým rozměrům jsou viry nejobtížněji detekovatelnou kontaminací buněčných kultur, přičemž detekce vyžaduje metody, které jsou ve většině výzkumných laboratoří neproveditelné. Jejich malá velikost je též činí velmi obtížně odstranitelnými z média, séra a jiných roztoků biologického původu. Běžně má většina virů striktní požadavky na buněčné pochody jejich původního hostitelského druhu (mohou být též tkáňově specifické), což velmi limituje jejich schopnost infikovat buněčnou kulturu jiného druhu. Ačkoliv mohou být viry v buněčných kulturách běžnější, než si většina vědců myslí, nejsou považovány za vážný problém, pokud nemají cytopatický nebo jinak nežádoucí efekt na kulturu.
Nicméně Uphoff a kol. při prozkoumání 577 lidských buněčných linií na přítomnost virů myší leukemie (murine leukemia viruses, MLV) zjistili, že devatenáct (3,3 %) bylo kontaminováno MLV. Sedmnáct těchto buněčných linií vykazovalo produkci aktivních retrovirů určených pomocí RT-PCR detekce reverzní transkriptázové aktivity (product-enhanced reverse transcriptase PCR assay). Domnívají se, že nejpravděpodobněji stojí za MLV kontaminací pasážování lidských nádorových buněk s imunodeficientními myšmi ke zjištění rakovinotvornosti buněk. Je také možné, že je důvodem použití vrstev myších podpůrných buněk v průběhu vytváření lidských buněčných linií nebo jde o praktiku, v rámci které se snaží zbavit kontaminovaných buněčných linií pasážováním přes myši.
Jelikož cytopatické viry většinou zničí infikovanou kulturu, samy se tím omezují. Pokud dojde k samovolnému zániku kultury bez zjevného důvodu a nejsou zde důkazy běžné biologické kontaminace, za viníky jsou obvykle označeny skryté viry. Viry jsou perfektními viníky, jsou neviditelné a nezjistitelné; vinné bez přímého důkazu. To je velmi nešťastné, jelikož skutečným důvodem zničení kultury může být něco úplně jiného, třeba mykoplazma nebo chemická kontaminace.
Volně se vyskytující i parazitičtí jednobuněční prvoci, např. améby, mohou být čas od času identifikováni jako kontaminace kultury. Améby, obvykle půdního původu, mohou tvořit spory a jsou snadno izolovatelné ze vzduchu, občas ze tkání, a stejně tak z výtěrů krku a nosu laboratorního personálu. Mohou způsobit cytopatické efekty podobné virovému poškození a během deseti dnů kompletně zničit kulturu.
Hmyz a pavoukovci běžně se vyskytující v laboratorních prostorech, především mouchy, mravenci, švábi a roztoči, mohou sami kontaminovat kulturu, či být významným zdrojem mikrobiální kontaminace. Častým zdrojem zamoření jsou inkubační místnosti. Pobíháním dovnitř a ven z kultivačních nádob a sterilních zásob při hledání potravy či úkrytu mohou náhodně šířit mikrobiální kontaminaci. Občas jsou odhaleni na základě cestiček a stop (mikrobiálních kolonií), které zanechali na agarových plotnách, většinou však nezanechávají žádné jiné viditelné známky své návštěvy než náhodnou mikrobiální kontaminaci.
Roztoči mohou být vážným problémem v zařízeních s rostlinnými buněčnými kulturami, zejména v těch, které množí rostliny ve velkém množství. Ačkoliv bakterie, kvasinky a plísně občas zanechávají dojem, že „přeskakují“ z kultury do kultury, tyto vícenohé kontaminanty skutečně mohou.
Mykoplazma
Mykoplazmy byly poprvé detekovány v buněčných kulturách Robinsonem a jeho spolupracovníky v roce 1956. Pokoušeli se studovat efekty PPLO (pleuropneumonia-like organisms - původní název mykoplazmy) na HeLa buňkách, když zjistili, že kontrolní HeLa kultura již byla PPLO kontaminována. Navíc zjistili, že byly též infikovány další buněčné linie v té době používané v jejich laboratoři, což je běžná vlastnost kontaminace mykoplazmou.
Na základě testování mykoplazmy provedené FDA, ATCC a dvou hlavních společností testujících buněčné kultury bylo zjištěno, že nejméně 11-15 % buněčných kultur v té době používaných ve Spojených státech bylo infikováno mykoplazmou.
Jelikož mnoho z těchto kultur bylo z laboratoří, které rutinně na mykoplazmata testovaly, aktuální počty jsou pravděpodobně vyšší v mnoha laboratořích, kde netestují vůbec. V Evropě byly hodnoty kontaminace mykoplazmou ještě vyšší: přes 25 % z 1949 kultur z Nizozemska a 37 % z 327 kultur z bývalého Československa bylo pozitivních.
Československá studie měla zajímavá, byť typická zjištění: 100 % kultur z laboratoří bez programu testování mykoplazmy bylo kontaminováno, ale pouze 2 % kultur z laboratoří, kde testovali pravidelně.
Bohužel, mykoplazmy nejsou pouze relativně neškodné kontaminanty, ale právě naopak. Mají schopnost změnit u hostitelské buněčné kultury funkce, růst, metabolismus, morfologii, přilnavost, membrány, uvolňování virů a jejich množství, indukce a množství interferonů, chromozomální anomálie a poškození a cytopatické efekty včetně tvorby plaků. Tedy správnost jakéhokoliv výzkumu provedeného s těmito nevědomky infikovanými kulturami je přinejlepším pochybná.
Co dává mykoplazmám schopnost tak snadno infikovat tolik kultur?
- Malá velikost a absence buněčné stěny umožňuje mykoplazmám narůst v buněčné kultuře do velmi vysokých denzit (hodnoty 107 až 109 kolonie tvořících jednotek/mL jsou běžné), často bez viditelných známek kontaminace - žádný zákal, změny pH či cytopatické efekty. Samotné pozorné mikroskopické pozorování živých buněčných kultur nemůže odhalit jejich přítomnost.
- Tyto dvě stejné vlastnosti činí mykoplazmy, stejně jako viry, velmi obtížně zcela odstranitelné ze séra membránovou filtrací.
- Jejich striktní růstové požadavky (bohužel snadno splnitelné buněčnou kulturou) je navíc činí velmi obtížně pěstovatelné a detekovatelné s použitím standardních kultivačních metod.
Mykoplazmy jsou popisovány jako „plevel“ buněčné kontaminace, což je velmi mírný popis pro nejvýznamnější a nejrozšířenější kontaminantu buněčných kultur na světě. Bohužel i přes pokroky v detekčních metodách se míra infekce mykoplazmou od doby, kdy byla poprvé zaznamenána v buněčné kultuře, výrazně nezměnila.
Řešení problémů v buněčné kultivaci
Buněčná kultivace je základem mnoha moderních biologických, lékařských a farmaceutických výzkumů. Navzdory pokročilým technologiím a stále lepším nástrojům je tento proces stále spojen s řadou potenciálních problémů. Správná identifikace příčin poruch a implementace účinných nápravných strategií má zásadní význam pro zachování kvality, opakovatelnosti a spolehlivosti výsledků. Níže uvádíme nejčastější problémy buněčné kultivace spolu s praktickými řešeními, která mohou podpořit práci ve výzkumných a průmyslových laboratořích.
Adaptace buněk na nové podmínky
Jednou z prvních výzev, se kterými se setkávají vědci pracující s buněčnými liniemi, jsou problémy spojené s adaptací buněk na nové environmentální podmínky. To je zvláště patrné po rozmrazení buněk, kdy se pozoruje jejich omezená adheze k substrátu, zpožděný růst nebo zvýšená úmrtnost. Hlavními faktory vedoucími k těmto problémům jsou nesprávná teplota média, náhlé změny pH a nevhodné kultivační médium. Stejně důležitá může být kvalita a typ kultivačních nádob - ne všechny adherentní buňky efektivně přilnou ke standardním povrchům. Absence vhodné adhezní vrstvy nebo nízká kvalita materiálu může výrazně snížit účinnost kultivace.
Pro zlepšení přilnavosti a kondice buněk je vhodné používat specializované nádoby s modifikovaným povrchem. Doporučenou praxí je také pomalá adaptace buněk na nové podmínky postupným zvyšováním podílu nového média v následných pasážích. Takový postup omezuje riziko osmotického šoku a zvyšuje přežití buněk.
Kontaminace buněčných kultur
Jednou z nejzávažnějších hrozeb při práci s buněčnými kulturami jsou kontaminace. Bakteriální, plísňové, virové a - obzvláště nebezpečné - mykoplazmové infekce mohou vést nejen k úplné ztrátě kultury, ale také k jemným a obtížně detekovatelným fenotypovým a genetickým změnám. Mikrobiologické kontaminace jsou často výsledkem nedostatečné aseptiky, používání prošlých nebo špatně skladovaných činidel a také nesprávného fungování filtračních systémů v inkubátorech nebo laminárních boxech.
Mykoplazmata představují zvláštní výzvu, protože nezpůsobují zakalení média, ale zároveň mohou ovlivňovat genovou expresi, proliferaci a reakci buněk na experimentální podněty.
Prevence kontaminací vyžaduje zavedení přísných aseptických postupů, pravidelné monitorování stavu kultury a používání vysoce kvalitního jednorázového vybavení. V boji proti infekcím jsou užitečná také vhodně zvolená média s přídavkem antibiotik a systémy vzduchové filtrace. Nesmírně důležitým prvkem prevence je vzdělávání laboratorního týmu - aktuální informace a tipy pro práci s buněčnými kulturami lze nalézt v článcích publikovaných na blogu Genoplast.
Abnormální růst buněk
Abnormální růst buněk, zpožděný průchod buněčným cyklem nebo atypická morfologie jsou problémy, které se mohou vyskytnout i v podmínkách bez kontaminace a při správné adaptaci. Jejich příčiny je třeba hledat ve složitých fyziologických a environmentálních faktorech, jako je nedostatek živin, nadměrná hustota kultur, oxidační stres, přítomnost toxických nečistot v médiu nebo nevhodné inkubační podmínky. Nevhodná hladina CO2, kolísání teploty nebo příliš nízká vlhkost v inkubační komoře mohou vést k buněčnému stresu a poruchám funkce buněk. Podobně nekontrolované dosažení vysoké konfluence buňkami může spustit mechanismy kontaktní inhibice růstu a změny v genové expresi.
Problémy v buněčné kultivaci jsou nedílnou součástí práce s kulturami in vitro, ale díky použití správných postupů, vhodného vybavení a přísné kontroly environmentálních podmínek lze výrazně snížit riziko jejich výskytu. Klíčový význam má: kvalita používaných materiálů a médií, vzdělávání personálu a schopnost rychle reagovat na první známky abnormalit.
Pravidelné využívání aktuálních zdrojů znalostí je také důležitým prvkem péče o vysokou kvalitu a opakovatelnost výzkumné práce.
tags: #kultivace #bunek #znecisteni #prevence
Oblíbené příspěvky:
Kontakt
Zelaná Hrebová, z.s.
[email protected]
IČ: 06244655
Paskovská 664/33
Ostrava-Hrabová
72000
Bc. Jana Veclavaková, DiS.
tel. 774 454 466
[email protected]
Jaena Batelk, MBA
tel. 733 595 725
[email protected]