Testy toxicity pro vodní ekosystémy: Metody a význam

Ekotoxikologie je interdisciplinární vědní obor kombinující poznatky vědy studující ekosystémy (ekologie) a vědy studující interakce chemických látek s živými organismy (toxikologie).

První definice ekotoxikologie (1969) od Reného Truhauta zní: studium nepříznivých účinků chemikálií s cílem chránit přírodní druhy a společenstva.

Rachel Carson (1962) ve své monografii The Silent Spring poukazuje na používání pesticidů, především DDT a dalších agrochemikálií. Kniha vedla v USA k založení Úřadu pro ochranu životního prostředí (US Enviromental Protection Agency EPA).

Zavádění metod popisujících toxické účinky lidmi produkovaných látek na životní prostředí a v něm obsažené organismy. Systematické zavádění metod testování toxicity na rybách.

Ekotoxikologické testy sledují reakce, kdy je určený, často jednoduchý organismus dobře známými životními projevy, stavbou těla a fyziologií v uměle připraveném prostředí vystaven známé koncentraci známé látky nebo je daný organismus vystaven působení neznámého prostředí (např. dafnie ve vodě o různých koncentracích solí těžkých kovů).

Čtěte také: Možnosti studia na UHK

Z reakce organismu se usuzuje na rizika plynoucí z expozice sledované známé nebo neznámé noxy pro volně žijící populace téhož či jiného organismu, který se např. testovaným exponovaným organismem živí nebo je mu způsobem života (či metabolismem) příbuzný.

Člověk je dobře charakterizován, menší chyby při extrapolacích testů. Zúžený zájem - organismy vs. prostředí.

Toxicita je vlastnost látek vyvolávat poškození organismu. Vztah chemické analýzy a toxických účinků látek a environmentálních vzorků.

Ekotoxicita je obecně definována jako toxické působení na životní prostředí a živé organismy, účinek cizorodých látek na přítomná společenstva organismů v prostředí (rostliny a živočichové, včetně člověka).

Tento článek se zabývá využitím effect-based metod (EBM) ke kvalitativnímu hodnocení stavu povrchových vod v kontextu směrnice 2000/60/ES ustavující rámec pro činnost Společenství v oblasti vodní politiky a připravované novely směrnice 2008/105/ES, o normách environmentální kvality.

Čtěte také: Využití klimatických komor v praxi

Současně prováděný monitoring prioritních látek a specifických znečišťujících látek nezachytí veškeré zdroje znečištění, které mohou negativně ovlivňovat jakost povrchových vod.

Stejně tak nynější praxe neumožňuje komplexní hodnocení směsí, včetně emergentních polutantů, metabolitů a transformačních produktů látek na kvalitu vod.

Effect-based metody využitím ekotoxikologického hodnocení znečištění vod mohou zachytit celkový biologický vliv látek v tomto znečištění obsažených (včetně synergických účinků).

Rámcová směrnice o vodě 2000/60/EC vyžaduje od členských států Evropské unie (EU) integrovaný přístup k monitoringu a hodnocení kvality povrchových vod. V ČR monitoring probíhá v souladu s požadavkem Vyhlášky 98/2011 ve znění §21 vodního zákona a normami kvality životního prostředí v rámci celé EU.

Současný monitoring chemického stavu vod však neumožňuje z technických a ekonomických důvodů analyzovat, detekovat a kvantifikovat všechny látky přítomné ve vodním prostředí. Je předně zaměřen na sledování vybraných regulovaných chemických látek - prioritních, prioritních nebezpečných a dalších látek znečišťujících, u nichž je známo, jaké nebezpečí pro vodní prostředí představují.

Čtěte také: Environmentální výchova: Testy a materiály

Tyto informace však nevypovídají nic o jejich skutečných souhrnných účincích ve vodním prostředí. Do monitoringu je navíc nutné zahrnout i působení tzv. emergentních mikropolutantů.

Mezi ně řadíme léčiva a kosmetické přípravky, biocidy, polární pesticidy, endokrinní disruptory, jejich metabolity a transformační produkty.

Hlavním cílem projektu „Využití effect-based metod k hodnocení stavu povrchových vod v kontextu Rámcové směrnice o vodě“ je vytvoření metodiky pro hodnocení znečištění vod pomocí effect-based metod (EBM), jejichž po­užití by bylo vhodné začlenit do Rámcové směrnice o vodě (Water Framework Directive, zkratka WFD) 2000/60/ES.

Tento typ monitoringu je užitečným ekotoxikologickým nástrojem pro hodnocení znečištění vod sloužícím jako screeningová metoda, dovolující cílené zaměření dalších druhů monitoringu a v návaznosti na to nalezení původu znečištění a nastavení opatření ke zlepšení stavu vod.

EBM jsou analytické metody využívající celkové odpovědi organismu (in vivo) nebo buněčné odpovědi (in vitro) k detekci a kvantifikaci působení různých skupin chemikálií a k určení relevantních toxikologických endpointů.

EBM mohou pomoci prioritizovat problematické skupiny látek, což je využitelné pro návrhy cílených opatření ke snížení jejich vnosu a ke zlepšení stavu vod. Dalším důležitým aspektem jejich použití je potenciál snížit zátěž spojenou s monitoringem stále rostoucího seznamu prioritních a znečišťujících látek.

EBM jsou vhodné k propojení monitoringu chemického a ekologického stavu vodního prostředí a mohou napomoci ke stanovení příčin nevyhovujícího ekologického stavu vod a k identifikaci dalších látek, jež mohou být hrozbou pro vodní ekosystémy a lidské zdraví.

Použité metody byly vybrány s ohledem na pokrytí různých mechanismů účinku toxických látek na základě potřebné citlivosti. Podkladem byla technická zpráva EU a další zdroje.

S ohledem na malý objem vzorku po provedení nutné předúpravy byly zvoleny testy ekotoxicity na zástupcích dvou trofických vrstev vodních ekosystémů - na destruentech (bakterie Aliivibrio fischeri) a primárních producentech (zelené řasy Raphidocelis subcapitata). Mutagenita byla stanovována pomocí Amesova fluktuačního testu.

V posledních letech se v souvislosti s kvalitou vod pozornost zaměřuje na estrogeny a látky s estrogenním účinkem.

K hodnocení stavu povrchových vod pomocí EBM bylo na základě dat ČHMÚ a konzultací se státními podniky Povodí vytipováno 11 lokalit ve třech povodích (povodí Odry, Moravy a Labe).

Devět lokalit vykazuje dlouhodobě špatnou jakost vod, která je ve většině případů způsobena nadlimitními koncentracemi fosforu a dusíku, ale i zvýšeným výskytem některých prioritních a dalších znečišťujících látek a kovů (dle Nařízení vlády č. 401/2015 Sb.). Dvě lokality byly vybrány jako referenční s udávanou dlouhodobě dobrou jakostí vod.

V roce 2021 a 2022 proběhlo celkem šest vzorkovacích kampaní.

Předúprava vzorků spočívá v zakoncentrování znečištění v nich obsaženého. Zakoncentrování odebraných vzorků bylo provedeno dle TNV 75 7231.

K 20 litrům vzorku povrchové vody byly přidány XAD pryskyřice a vzorek promícháván po dobu 24 hodin. Poté byly adsorbované látky vymyty rozpouštědlem a převedeny do vodného 1 000x zakoncentrovaného vzorku.

Při provádění testů byla v některých případech zaznamenána zvýšená toxicita slepých vzorků. Protože byl vyloučen vliv rozpouštědla, předpokládali jsme vliv zbytkové toxicity po kondicionaci polymerních pryskyřic (XAD rezinů).

XAD reziny jsou komerčně dodávány a uchovávány v nádobách vlhké s přídavkem chloridu sodného a uhličitanu sodného, aby bylo zabráněno nežádoucímu mikrobiálnímu nárůstu.

Kromě toho mohou být na reziny z procesu výroby nasorbovány další nežádoucí látky, které mohou negativně ovlivnit výsledky samotných testů ekotoxicity. Původní postup pročištění methanolem a následný oplach demineralizovanou vodou byl na základě dat získaných rešerší upraven.

Reziny byly pročišťovány a kondiciovány v soxhletových extraktorech po dobu 8 hodin methanolem a následně 8 hodin acetonem. Jde totiž o rozpouštědla, která jsou v dalších krocích testování používána i při samotné extrakci sorbovaných látek a jsou také doporučována výrobci XAD rezinů.

Kromě změny kondicionace XAD pryskyřic byla provedena i změna oproti TNV 75 7231 v provedení extrakce. Zmíněná norma doporučuje k extrakci aceton.

Jako druhé činidlo byl přidán methanol, který je polárnějším rozpouštědlem ve srovnání s acetonem a je vhodný např. k extrakci široké řady pesticidů a farmak, kdy by mělo dojít k rozšíření extrahovaných látek o zmíněné látky s vyšší polaritou.

Změny v extrakčních postupech zahrnovaly promíchávání rezinů se sorbovanými látkami v koloně po dobu 30 minut s methanolem. Methanolový extrakt byl z kolon slit do předpřipravených nádob.

Poté byl k rezinům do kolon přidán postupně, ve dvou následujících krocích, na dobu dvakrát 15 minut aceton. První acetonový extrakt obsahoval i malé množství methanolu z prvního kroku extrakce, proto byly po 15 minutách sorbované látky na rezinech extrahovány opětovně čistým acetonem.

Takto vzniklé methanolové a acetonové extrakty byly nejprve zahuštěny do objemu 5 ml na vakuové rotační odparce Heidolph (při teplotě vodní lázně 50 °C, při tlaku 300 mbar pro methanolový extrakt a 550 mbar pro acetonový extrakt).

Do konečného objemu 100 µl byly extrakty dofoukány dusíkem. Zahuštěný acetonový i methanolový extrakt byl doplněn do objemu 10 ml demineralizovanou vodou.

Testy toxicity

Luminiscenční test s A. fischeri

Stanovení inhibičního účinku vzorků na světelnou emisi mořských luminiscen­čních bakterií Aliivibrio fischeri bylo provedeno dle normy ČSN EN ISO 11348-2. Jde o mořské aerobní, heterotrofní, gram-negativní bakterie schopné bioluminiscence.

Emitace světla vzniká katalytickými účinky enzymu luciferázy na nízkomolekulární substrát luciferin. Vlivem toxických látek obsažených v testovaném vzorku dochází ke snížení luminiscence emitované těmito bakteriemi. Tato snížená hodnota je zaznamenávána a porovnána s kontrolou. Výsledky analýz bioluminiscenčního testu jsou obsaženy v tab. 2 v hodnotách EC50 (ml/l).

Miniaturizovaný řasový test s R. subcapitata

Test inhibice růstu sladkovodních zelených řas vychází z normy ČSN EN ISO 8692. Z důvodu omezeného množství získaných zakoncentrovaných vzorků byla použita miniaturizovaná metoda řasového testu.

Miniaturizovaná verze testu neprobíhá v Erlenmeyerových baňkách, ale na 96jamkových mikrotitračních destičkách. Základní roztoky a podmínky provedení testů zůstávají shodné s již zmíněnou normou.

Podstata zkoušky spočívá v kultivaci řasové kultury R. subcapitata ve vzorcích s přídavkem živného média, nezbytného pro růst řas. Kultivace probíhá v testovací místnosti se stálou teplotou 22 °C, při intenzitě světla pohybující se nad 6 000 lx. Po uplynutí 72 hodin je porovnána specifická růstová rychlost zkoumaných vzorků s kontrolním vzorkem.

Výsledné hodnoty analyzovaných vzorků jsou vyjádřeny v % inhibice (popř.

Amesův fluktuační test

Amesův fluktuační test (ISO 11350) byl použit pro detekci přítomnosti látek s mutagenním účinkem. Tento test prostřednictvím dvou geneticky modifikovaných bakteriálních kmenů Salmonella enterica subsp. enterica serotyp Typhimurium TA 98 a TA 100 sleduje výskyt přímých a nepřímých mutagenů ve vodném prostředí.

Použitím obou zmíněných kmenů TA 98 a TA 100 je umožněno ve vzorcích detekovat látky, které indukují bodové mutace (substituce bází a posunové mutace) v genech kódujících enzymy, které se účastní biosyntézy aminokyseliny histidinu. Dvojnásobné zvýšení počtu revertant je považováno za signifikantní.

U Amesova testu bývá doporučováno i hodnocení cytotoxických účinků vzorků na bakteriální kmeny salmonel, založené na hodnocení růstové rychlosti bakteriálních kmenů v porovnání s kontrolními vzorky.

Zjišťování cytotoxicity je doporučováno normou ISO 11350 pouze pro kmen salmonel TA 98. U kmene TA 100 může z důvodu nižší růstové rychlosti dojít ke zkreslení výsledků.

V roce 2022 bylo přistoupeno k otestování vzorků i ve variantě Amesova testu s metabolickou aktivací S9+, sledující nepřímé mutageny, které vyžadují metabolickou aktivaci jaterními enzymy, aby se projevil jejich mutagenní účinek.

tags: #testy #toxicity #pro #vodní #ekosystémy #metody

Oblíbené příspěvky:

• Interaktivní výuka o přírodě pro děti
• Příznaky srdeční arytmie
• Jižní Afrika: životní prostředí
• Jeřáb oskeruše a jeho využití
• Recenze odpadkových košů