Analýza DNA a znečištění vzorků: Komplexní pohled

26.11.2025

Testy DNA, genetické testování a genetická analýza představují velice široký pojem. Zahrnuje nejrůznější vyšetřovací a detekční metody, které analyzují DNA, její dynamiku a regulaci nejen v buňkách lidského těla. Moderní genetická analýza je založená na analýze genetického materiálu v podobě DNA, RNA, mitochondriální DNA (mtDNA) nebo volné DNA (cfDNA). Princip izolace tohoto materiálu je až na menší specifika stejný. Standardní izolační kit váže nukleové kyseliny přítomné ve vzorku na kolonku, kde je DNA poté dále přečišťována a nakonec vymyta do stabilizačního roztoku.

Metody analýzy DNA

Existuje několik základních metod používaných při analýze DNA:

PCR (Polymerázová řetězová reakce): PCR, jinak také polymerázová řetězová reakce, je nejspíš nejvíce používanou laboratorní metodou, která slouží k amplifikaci (namnožení) úseků DNA. Cílem této metody může být jak samotná detekce přítomnosti určité sekvence DNA, tak zmnožení konkrétního úseku, který je následně využit v dalších metodách. Principem je navržení a užití primerů neboli sond, tedy krátkých úseků DNA, které specificky rozeznají zvolenou sekvenci, před jejíž začátek a konec nasedají a tím ji označí pro polymerázu, která pak po zvýšení teploty nad požadovanou mez tento úsek zkopíruje do nově syntetizované molekuly a po snížení teploty odpadne.
End-point PCR: Na rozdíl od běžné PCR, kde se analyzuje až výsledný produkt pomocí elektroforézy v agaróze, je při Real-time PCR zaznamenáván každý cyklus PCR ve skutečném čase.
Real-time PCR: Kvantitativní polymerázová řetězová reakce (nejčastěji označovaná jako Real-time PCR nebo qPCR) je metoda založena na principu klasické PCR, umožňuje však kvantifikaci sledovaného úseku DNA. Záznam amplifikace je založen na principu fluorescence, kdy se používají značené sondy (fluorescenční látky), které se váží specificky nebo nespecificky na amplifikované úseky DNA. Fluorescence a její intenzita je snímána během celé reakce a následně počítačově vyhodnocována.
Elektroforéza: Úseky DNA, produkty PCR nebo produkty štěpení DNA můžeme analyzovat pomocí separačních metod jako chromatografie nebo elektroforéza (ELFO). Elektroforetické dělení na agarózovém nebo akrylamidovém gelu patří mezi nejpoužívanější metody separace DNA. DNA nesoucí záporný náboj se pohybuje v jednosměrném elektrickém poli od katody k anodě.
Sekvenování: Sekvenování nebo také sekvenace je metoda určená ke čtení genetického kódu čili k determinaci primárního pořadí (sekvence) nukleotidových bází v dvouřetězci DNA. Neboť jde v současnosti ještě stále o velmi pracnou a časově i finančně náročnou metodu mapování genetického kódu, je využívána především pro specifické výzkumné účely, případně se její pomocí určuje přesná sekvence předem amplifikovaného úseku DNA (typicky jednoho pocházejícího z PCR reakce). Zatímco dříve bylo tuto metodu nutno provádět ve čtyřech zcela oddělených reakcích, dnes je již plně automatizována, čímž se značně snížila její pracnost a náročnost na čas. Naštěstí se v poslední době objevilo několik zcela nových metod, které dovolují řádově vyšší rychlost sekvenace a které souhrnně označujeme jako metody druhé generace (next generation sequencing). I tyto moderní metody sekvenování stejně jako klasické vyžadují následnou pracnou bioinformatickou analýzu při sestavování „přečtených“ úseků, neboť výstupem každého sekvenování není ucelená sekvence nukleotidů, nýbrž tzv.
Hybridizace DNA: Po izolaci genetického materiálu je třeba uchytit vzorek DNA na sondy, které mikročip obsahuje, přičemž na jednom mikročipu je jich hned několik milionů najednou. Tato fáze využívá mechanismus hybridizace, kdy je DNA fragmentována, a pouze takový fragment, jehož sekvence odpovídá sekvenci dané sondy, se na tuto sondu naváže. Celý krok hybridizace je časově náročný a trvá několik dnů.
Skenování: V dalším kroku je mikročip s již hybridizovanou a značenou DNA skenován scannerem s vysokým rozlišením typu iScan. Jedná se o plně automatizovaný proces s možností opakování, pokud jsou výsledky nejednoznačné nebo neúplné.
Analýza dat: Posledním krokem je pak samotná analýza získaných dat. Tento krok je s ohledem na objem dat nejzdlouhavější. Analýza je prováděna na počítači speciálním softwarem (GenomeStudio) dodávaným rovněž firmou Illumina.
Restrikční analýza DNA: Restrikční analýza DNA je metodou charakterizace DNA pomocí jejího štěpení restrikčními endonukleázami (RE) na fragmenty. RE jsou bakteriální enzymy, které štěpí specifické sekvence. Původně měly ochrannou funkci před cizorodou DNA, dnes se využívají také v genetice k charakterizaci DNA. a štěpí DNA na různě dlouhé fragmenty. Počet i délka fragmentů je pro daného jedince specifická. Identifikace a analýza produktů štěpení se provádí elektroforetickým dělením na gelu nebo kapilární elektroforézou. Odlišení různých vzorků DNA se provádí na základě polymorfismu délky štěpných úseků. Tento polymorfismus vzniká na základě přítomnosti nebo nepřítomnosti rozpoznávacích a štěpných míst.

Využití analýzy DNA

Analýza DNA má široké spektrum využití v různých oblastech:

Testování otcovství: Když si nejste jistý otcovstvím a chcete znát pravdu, můžete využít náš test otcovství. Test je spolehlivý stejně jako soudní test, jen můžete odběry vzorků provést sami doma a můžete si ponechat svou anonymitu. Odběrovou sadu Vám můžeme zaslat na zvolenou adresu, na pobočku Uloženky / Zásilkovny nebo si ji můžete vyzvednout osobně v laboratoři Genomia v Plzni.
Forenzní genetika: Současná kriminalistická, resp. trestně-právní teorie i praxe ve značné míře předjímá, že identifikace pachatelů trestných činů podle analýzy DNA je víceméně neomylná, přičemž této kategorii důkazů je přikládán klíčový význam.
Genetická genealogie: Pomocí analýzy DNA metodami genetické genealogie můžeme zjistit zajímavé informace o mužských rodových liniích, zejména o místě jejich vzniku, ale třeba i nalézt v současné populaci příbuzné, se kterými sdílíme nejen stejné či podobné příjmení, ale i stejný nebo podobný chromozom Y.
Prediktivní genetická analýza: Prediktivní genetickou analýzu je možné chápat jako rozbor možných genetických predispozic pro celý soubor vybraných nejčastěji se vyskytujících chorob a nestandardních odlišností metabolismu u konkrétního člověka dřív, než dojde k prvním projevům.
Stanovení karyotypu: Karyotypem máme na mysli soubor všech chromozómů ukrývajících se v jádru buňky. o haploidní buňky. Smyslem stanovení karyotypu u daného jedince je především detekce správného počtu chromozomů a případné vyloučení zásadních chromozomových aberací, tedy přestaveb a porušení jejich struktury.
Analýza mitochondriální DNA (mtDNA): Relativně malá, ale důležitá skupina genů se nachází mimo jadernou DNA v buněčných organelách zvaných mitochondrie. V buňkách se nachází stovky těchto důležitých organel, které obsahují genetický materiál kódující pouze několik genů. Většina genů potřebných pro chod mitochondrií je kódována jadernými geny.

Rizika a spolehlivost analýzy DNA

I přes vysokou spolehlivost analýzy DNA je třeba brát v úvahu potenciální rizika a faktory ovlivňující její přesnost:

Znečištění vzorku: Chybovost genetické analýzy může v kriminalistice dosahovat 2 až 5 %. Doktor Vaněk, stejně jako profesor Slobogin, zdůrazňuje potřebu akreditace laboratoří a zamezení kontaminace vzorku DNA, avšak upozorňuje i na další palčivý problém, kterým je špatná interpretace vzorků.
Chybná interpretace: Humanitně vzdělaný soudce spoléhá na posudek znalce, který však nemusí mít vystudovanou genetiku nebo má v oboru mizivé zkušenosti.
Stáří vzorku: Nad shora uvedené je v neposlední řadě třeba dodat, že u vzorků DNA nelze přesně určit jejich stáří, a tak může být pachatelem účelově přineseno na místo činu DNA jiné nevinné osoby a od toho tu jsou policejní orgány, soudci a státní zástupci, aby přistupovali k důkazům jak jednotlivě, tak v jejich vzájemných souvislostech.
Chybovost: Studie 268 případů v USA zjistila, že chybné závěry byly učiněny v 96 % těchto případů - ve 35 případech byl obžalovaný odsouzen k trestu smrti a 9 z těchto lidí bylo popraveno. Neznamená to ale, že tito lidé byli nevinní. Chybné závěry se týkaly čehokoli, co mělo cokoliv společného s testováním DNA, a některé byly marginální.

Vliv znečištěného ovzduší na DNA

Znečištěné ovzduší způsobuje zdravotní problémy spojené se záněty, změnami v DNA a smrtí buněk. Může zhoršovat nemoci jako astma a přispívat ke vzniku Alzheimerovy choroby. Vědci se také rozhodli studovat, jakým způsobem škodlivé částice ovlivňují buňky pacientů, kteří trpí Alzheimerovou chorobou. Buňky na znečišťující látky reagují různorodě. Imunitní systém částice rozpozná jako hrozbu a aktivuje se, přičemž může vzniknout zánět. Dalším následkem škodlivin je oxidační stres, při kterém nadbytek nestabilních molekul v těle způsobuje poškození nebo smrt jinak zdravých buněk nebo změny v DNA. Tyto reakce mohou podnítit aktivitu tzv. onkogenů, které mohou přispět ke vzniku rakoviny.

Čtěte také: Metodiky analýzy podzemních vod

Vliv znečištěného ovzduší má vliv na zhoršení genetických vlastností spermií, konkrétně na takzvanou integritu chromatinu, tedy komplexu DNA a některých proteinů. Výzkumníci sledovali dopad ovzduší na funkční a genetické vlastnosti spermií u skupin městských strážníků v Ostravě, Praze a v Českých Budějovicích. Spoluautor výzkumu Jiří Rubeš uvedl, že plodnost mužů je velmi zranitelná, přičemž vliv má jak prostředí, v němž se člověk pohybuje, tak životní styl či profese. Proto vědci provedli výzkum mezi městskými strážníky - nekuřáky, které vyšetřili ve dvou obdobích - na jaře a na podzim 2019.

Vědci pracovali s údaji, kdy průměrná čtvrtletní koncentrace karcinogenního PAU benzo[a]pyrenu v ovzduší v Ostravě v prvním čtvrtletí činila 4,6 nanogramů na metr krychlový, zatímco za třetí čtvrtletí 0,6. V Praze a Českých Budějovicích byly tyto hodnoty výrazně nižší.

Ve dvou různých obdobích odebrali vzorky od 65 městských strážníků. Různá míra znečištění se pak podle Jiřího Rubeše odrazila v narušení chromatinu ve spermiích u sledovaných vzorků.

V případě Ostravy tým zjistil, že medián narušení chromatinu činil 22,6 procenta na jaře a 18,6 procenta na podzim, což označili za velmi významný rozdíl. V Českých Budějovicích pak byly podle Rubeše naměřené hodnoty ohledně poruchy DNA hraniční, zdůraznil však, že tam pracovali s malým množstvím vzorků. V případě Prahy podotkl, že rozdíly nebyly statisticky významné.

Výsledky projektu podle něj nicméně jasně prokazují, že znečišťující látky v ovzduší podstatně přispívají k narušení DNA ve spermiích. Zhoršená oplozovací schopnost byla dosud popsána u mužů s více než 15 procenty spermií s narušeným chromatimem. Nad 25 procent je podle vědců už zjištěna výrazná ztráta schopnosti oplodnění.

Čtěte také: Zdroje rizik a ohrožení

Další část studie se zaměřila na biologický monitoring strážníků a jejich zatížení škodlivými chemickými látkami. Podle Jany Pulkrabové z Vysoké školy chemicko-technologické v Praze výzkum prokázal zvýšené hladiny hydroxylovaných metabolitů polycyklických aromatických uhlovodíků v moči ostravských strážníků. Tyto látky jsou podle vědců sledovány například z důvodu jejich karcinogenních účinků. Pulkrabová nicméně podotkla, že z těla jsou vylučovány poměrně rychle.